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劉森泉 2013-12-23 11:38
你好,請教你一些問題。我現在在做ES向造血分化,用的是無基質無血清的方法,用的是鄧宏魁老師發在cell research的protocol,但是我分化2天后細胞全部漂浮起來了,之后一直養著,有點像細胞碎片,不像細胞的樣子。也檢測不到CD34和CD45,不知道什么情況。你之前是怎么做的呢?謝謝!
劉森泉 2013-3-16 19:35
wwy551: 你先確定一下你想要克隆的基因在你選取的細胞里面是有表達的。拿到cDNA之后建議做巢式PCR擴增目的基因,就是分兩步做:先用一對primer擴目的基因兩端外側的區域, ...
那怎么才能知道克隆的基因在哪個細胞里表達啊?有這樣的網站嗎?這些基因一般不是都在造血干細胞里表達嗎,可是造血干很少很難拿到。還有,問下,你原來的老板鄧宏魁實驗室是不是都有這些基因啊?因為我老板跟他很熟,所以他有的話我可以叫老板問鄧教授拿。謝謝!
劉森泉 2013-3-16 14:58
你好!請問下你以前克隆過造血相關的基因是伐,比如SCL,RUNX1,GATA1/2這些,請問你是從什么細胞的mRNA克的啊?我用K562,NB4這些白血病細胞株,試了好久都沒克出來啊?
劉森泉 2013-3-13 22:11
wwy551: 這個其實我也沒有做過,我以前呆的Lab也并沒有標記的細胞系。找特定基因的啟動子,一般情況下是針對這個基因起始密碼子上游2000bp的區域設計primer,PCR擴增。當 ...
好的。我自己先試試。還是謝謝你!
劉森泉 2013-3-13 14:28
非常巧,在論壇里收細胞特異性表達基因構建又收到你的帖子,現在我也想做Lineage Tracing,就是將基因啟動子跟GFP連起來,做穩定細胞株的建立。想請教下具體的流程是什么?包括啟動子的查找、PCR擴增,載體的選擇等等。謝謝!
劉森泉 2012-7-8 08:25
wwy551: 可以這樣做,也可以直接把每孔的培養液吸掉,用下一階段分化用的基礎培養基把克隆洗一下,再換成分化培養基。這樣做防止上一階段殘留的細胞因子對接下來的分化造 ...
謝謝!可是細胞都懸浮著,很難把培養基吸出來,怎么操作比較好點?還有,顯微鏡下看上去很多死細胞,屬于正常情況嗎?
劉森泉 2012-7-7 11:54
你好。請教下ES向造血分化的過程細節,我昨天把ES轉到低粘附性六孔板里,用的還是ES培養基,今天看了下,全部飄在培養基里。那要往造血分化的話是把細胞再移出來,自然沉淀,再用分化培養基重懸培養嗎?之后每步分化都同樣操作嗎?謝謝!
劉森泉 2012-6-7 08:39
wwy551: 我們當時對實驗室的細胞因子庫及某些因子對應的拮抗劑做了screen,篩選出來了SB431542對終生造血的祖細胞發生有促進作用。
分化按stepwise進行,每一階段必須的因 ...
已經很感激你了,非常感謝!
請問你有鄧實驗室的研究生的聯系方式嗎?郵箱什么的。畢業的沒畢業的都可以,我想找他們要個論文不知道行不行。
劉森泉 2012-6-6 15:42
wwy551 : http://www.nature.com/cr/journal/v22/n1/full/cr2011138a.html 這是我之前在北大的一篇paper。我已經離開之前實驗室很久了,質粒之類的東西肯定是沒有的,抱歉 ... 你的文章我看了,做得很好,打算按照你的分步分化法來做做看。請教幾個問題: 1. 你怎么會想到采用TGFβ抑制劑來調節造血分化的呢? 2. 分化步驟很費錢啊,Matrigel包被的孔板好貴,還有,第一步分化你用的是BMP4和ACTIVIN A,在之前的WNT3A的blood方法比起來怎么樣?你試過之前的分化方法嗎,感覺哪個好點? 3. 這個SB431542有效果后有再進一步做其 ... ...
劉森泉 2012-6-6 08:38
wwy551: http://www.nature.com/cr/journal/v22/n1/full/cr2011138a.html
這是我之前在北大的一篇paper。我已經離開之前實驗室很久了,質粒之類的東西肯定是沒有的,抱歉 ...
已經很感激你了,非常感謝!
請問你有鄧實驗室的研究生的聯系方式嗎?郵箱什么的。畢業的沒畢業的都可以,我想找他們要個論文不知道行不行。
劉森泉 2012-6-5 13:00
wwy551: 不好意思,鄧博實驗室的畢業生每個人都會留下打印裝訂好的畢業論文,但是我現在手頭上還真沒有電子版的畢業論文。
那你以前在鄧實驗室發的文章能給我參考下嗎?還有,你們構建的質粒(RUNX1,SCL, HOXB4等等)你有嗎?非常感謝!
劉森泉 2012-6-5 08:54
wwy551 : 你好!我之前在北大生科院鄧宏魁的實驗室工作了三年,今年才去港大醫學院讀PhD,所以畢業論文就沒有啦~~你可以搜一下他們實驗室做造血的paper,三篇blood和一篇c ... 原來是鄧老師的學生啊,他好像今年要去同濟了。我是浙江大學醫學院的學生,老板是黃河,浙一醫院的醫生和浙大醫學院書記,在基礎方面(多能干)剛剛起步,你可能沒聽說過。我正好想按照鄧老師之前發的文章做ES向造血分化呢,那以后有細節不懂的就請教你咯。他實驗室發了一個BMP4,RA,Lycat三篇Blood,其中Lycat是按照他在國外做斑馬魚那篇文章做的小鼠模型, ... ...
劉森泉 2012-6-4 20:21
你好,怕公開聯系不方便,就私下聯系你了,見諒。我實驗剛開始,很多細節不是很清楚,你正好做過這方面的,非常難得。有個奢求,你能把之前實驗室做造血分化的畢業論文給我學習學習嗎?謝謝!
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